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| .: PRESTAÇÃO DE SERVIÇOS |
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| Teste Genético para Cancro Colorectal Hereditário não-poliposo (Síndrome de Lynch) |
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| O LGH pretende, a curto prazo, vir a efectuar Teste Genético para Cancro Colorectal Hereditário não-poliposo, em regime de prestação de serviços mediante requisição médica.
Conhecida a base genética da doença, o teste genético revelou-se de interesse não só para o indivíduo afectado como para os familiares de risco, demonstrando-se útil como complemento da avaliação e intervenção clínica nas etapas de:
- Rastreio/Determinação de predisposições
- Diagnóstico (confirmação)
- Selecção profilaxia adequada
- Vigilância da evolução patológica
- Aconselhamento genético
- Vigilância individual e de familiar
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O teste genético para Síndrome de Lynch envolve a determinação de Instabilidade de Microssatélites (IMS) e Tipagem dos genes MLH1 e MSH2. |
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| - Características da patologia |
| O Síndrome de Lynch ou HNPCC (Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer) traduz-se por um risco acrescido no desenvolvimento de Cancro Colorectal, na ordem dos 80%, (Aarnio et al. 1999) e representa 3 a 6% dos Cancros do Cólon Rectal Hereditários. A idade média registada para o seu diagnóstico é considerada precoce quando comparada com os de ocorrência esporádica (44 vs 63 anos), ocorrendo também a carcinogénese a uma taxa mais acelerada (2-3 vs. 8-10 anos). Está ainda associado a um acréscimo da incidência de cancros do endométrio, ovário, estômago, intestino delgado, tracto hepatobiliar, tracto urinário superior, cérebro e pele, variável de 60% para o primeiro a ~4% no caso do último (Aarnio et al. 1995, 1999; Davis & Cohen 1995; Vasen et al. 1996; Rodriguez-Bigas et al. 1997; Liu et al. 1996; American Cancer Society Surveillance Research 2002). |
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| - Componente genética |
Suspeitou-se de uma contribuição genética pelo padrão de incidência em famílias e pelo modo de transmissão hereditária da doença. É assim herdado de pais para filhos de uma forma autossómica dominante, pelo que as formas genéticas patológicas têm 50% de hipóteses de serem passadas à descendência. No entanto, sendo o indivíduo portador de uma variante patológica comprova-se uma predisposição, não que a doença se esteja a desenvolver. [+ info]
O estado patológico está normalmente associado a alterações nos genes MLH1, MSH2 (responsáveis em ~90% dos casos), MSH6 (7-10%) e PMS2 (<5%; Peltomäki 2001). Os chamados genes MMR (Mismatch Repair) codificam proteínas que monitorizam o ADN recém formado, identificando e reparando erros que ocorrem estocásticamente com o crescimento e divisão celular (Gruber & Kohlmann 2003). Quando os próprios genes estão alterados por mutações, a função reparadora das proteínas e sua capacidade de interacção são portanto afectadas. A acumulação de mutações somáticas na célula pode então tornar-se patológica. |
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| - Recomendação para teste genético |
| O teste genético, estabelecido em anos mais recentes, passou a ser possível graças ao conhecimento da base genética da patologia. A American Cancer Society, ao dar indicações para o rastreio e detecção prematura de adenomas colorectais, recomenda a realização do teste genético bianual até a idade de 40 e depois anualmente, para indivíduos com história familiar de HNPCC. Para os casos de cancro do cólon esporádico revela-se também informativo ao prever diferentes respostas à quimioterapia (Watanabe et al. 2001). |
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| - Estratégia de teste |
• Abordagem ao doente
O médico responsável informa o indivíduo sobre suspeita da possibilidade de efectuar o teste genético. São dados pormenores da componente genética da doença e dos detalhes do teste, devendo ser assinando um termo de consentimento
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• Colheita de material biológico
Recolha de sangue e de tecido tumoral/biopsia efectuada pelo clínico responsável, para posterior extracção de ADN segundo métodos estandardizados. É atribuido um código para fácil identificação e para que se salvaguarde o anonimato durante a restante análise.
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• Análise IMS
No caso particular do síndrome de Lynch, a evolução para carcinoma por acumulação de mutações somáticas no ADN do tecido tumoral, é avaliada utilizando microssatélites. Estes são sequências curtas repetidas em bloco, que se distinguem pelo número de repetições (Fregeau & Fourney 1993, Smith 1995), e cuja elevada taxa de mutação os torna mais susceptíveis de adquirir erros quando a função reparadora está alterada. O ADN tumoral passa a apresentar um número inconsistente de repetições quando comparado com o ADN normal, estado designado por instabilidade de microssatélites (IMS) e associado a um vasto leque de tumores (Mao et al. 1994, 1996).
Os loci BAT25, BAT26, D5S346 (APC), D17S250 (Mfd15CA) e D2S123 foram identificados como relevantes para casos de Síndrome de Lynch por correlação directa com a ocorrência de mutações nos genes reparadores de erros em MLH1 e MSH2. (Dietmaier et al. 1997), A IMS é detectada em 90% dos tumores de indivíduos HNPCC (Aaltonen et al. 1994) e está também reportado para 15% dos carcinomas colorectais esporádicos. O tumor é classificado como de alta-IMS se >30% dos marcadores registam instabilidade, baixa-IMS se inferior a 30% e estável-MS ou MSS na ausência de alterações (Boland et al. 1998). [+ info]
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| • Detecção de alterações epigenéticas
Existe ainda a possibilidade de se verificar a existência de metilação do promotor de MLH1, alteração somática que impede a transcrição do gene, situação frequente nos 15% de CRC esporádicos que são também IMS. Esta estratégia pode anteceder a tipagem germinativa, indicando assim os casos esporádicos.
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• Detecção de mutações na linhagem germinativa (recomendada para casos de alta-IMS e para indivíduos de famílias HNPCC)
- grandes delecções/duplicações por MLPA;
Uma percentagem significativa, na ordem dos 50% das mutações germinativas, são delecções de um ou mais exões dos genes MLH1 e/ou MSH2 (Wijnen et al, 1998). A técnica MLPA (Multiplex-Ligation Probe Amplification) permite detectá-las por variação de 35-50% da intensidade relativa dos produtos, significando que uma das cópias está alterada. São analisados os 19 exões de MLH1 e 16 exões de MSH2, por comparação com o perfil de indivíduos de controlo, sem história pessoal ou familiar da doença. (link MLPA)
- mutações pontuais por DGGE e sequenciação;
Como os genes são de longa extensão (ex. MLH1 possui 6.6 kilobases), pode-se optar por uma selecção preliminar da zona a estudar. Recorre-se assim à DGGE – Denaturating Gradient Gel Electrophoresis - método electroforético que detecta o movimento distinto das variavéis anormais de ADN, por acção de um gradiente. Assim seleccionam-se as porções que justificam a sequenciação de DNA, tornando o processo menos moroso e dispendioso. A tipagem de genes MLH1 e MSH2, pode ser no entanto feita directamente por sequenciação de exões. Informação actualizada sobre os polimorfismos normais e variantes patológicas pode ser encontrada na base de dados www.insight-group.org. [ver DGGE] [ver sequência]
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• Comunicação dos resultados
Os resultados são entregues ao clínico sob a forma de relatório e oportunamente comunicados ao paciente. Estima-se prazo normal de 1 mês para a IMS e MLPA e de três meses para sequenciação de MLH1 e MSH2.
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• Análise dos familiares de risco (opcional)
Quando confirmada a existência de mutação na linha germinativa pode-se proceder à análise dos familiares mais directos cujo padrão hereditário possa ter transmitido a foma genética.
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| - Interpretação dos resultados |
Quando a amostra revela ser IMS-instável, há uma forte associação à existência de mutações nos genes MLH1 e MSH2, e portanto de os microssatélites serem diagnosticantes de um caso de HNPCC. Assim sendo, e se igualmente cumprir o critério clínico de Bethesda, o indivíduo deve ser testado para mutações nos genes MMR. Conhecida a causa molecular segue-se para o rastreio dos familiares. Caso não sejam encontrados alelos patogénicos em MLH1 ou MSH2, restam poucas possibilidades de teste (<10% responsabilidade de mutações em MSH6 e/ou PMS2) e aumentam as probabilidades de se tratar de um cancro esporádico.
O nível de instabilidade só por si ajuda na vigilância de pólipos pré-cancerosos em HNPCC, dada a proporcionalidade com a taxa de evolução das mudanças patológicas, monitorizando-se assim a evolução a carcinoma. De salientar que em casos de alta-IMS a prognose é mais favorável que em MSS, independemente do estádio em que o tumor é diagnosticado. Conhecida esta base molecular, a terapia pode ser então redireccionada, já que se sabe que não respondem à quimioterapia com fluorouracil (Ribic et al. 2003, Carethers et al. 2004).
No caso do ADN do tecido tumoral ser IMS-estável, as ilações não são tão directas: pode tratar-se de individuos numa fase precoce da patologia, de alelos alterados em MSH6, ou de caso esporádico. em que a associação IMS não é tão directa. Na eminência de que certos adenomas em fase inicial não exibem IMS, pode-se optar por tipar as mutações da linha germinativa. |
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| Links úteis: |
Gene Reviews - Hereditary Non Polyposis Colon Cancer
IMS - kit Roche
MLPA MLH1, MSH2 |
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| Referências |
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Aaltonen LA, Peltomaki P, Mecklin JP, et al. Replication errors in benign and malignant tumors from hereditary nonpolyposis colorectal cancer patients. Cancer Res 1994; 54:1645-8.
Aarnio M, Mecklin JP, Aaltonen LA, Nystrom-Lahti M, Jarvinen HJ (1995) Life-time risk of different cancers in hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) syndrome. Int J Cancer 64:430-3
Aarnio M, Sankila R, Pukkala E, et al. Cancer risk in mutation carriers of DNAmismatch-repair genes. Int J Cancer 1999; 81:214-8.
Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, et al. A National Cancer Institute workshop on microsatellite instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res 1998;58:5248-57.
Carethers JM, Smith EJ, Behling CA, et al. Use of 5-fluorouracil and survival in patients with microsatellite-unstable colorectal cancer. Gastroenterology 2004;126:394- 401.
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Dietmaier, W. et al. (1997) Diagnostic Microsatellite Instability: Definition and Correlation with Mismatch Repair Protein Expression. Cancer Res. 57: 4749-4756.
Fregeau, C.J. and Fourney, R.M. (1993) DNA Typing with Fluorescently Tagged Short Tandem Repeats: A Sensitive and Accurate Approach to Human Identification. BioTechniques 15: 100-119.
Gruber SB and Kohlmann W (2003) The genetics of hereditary non-polyposis colorectal cancer. J Nat Comp Cancer Net 1:137-44
Liu, B. et al. (1996) Analysis of mismatch repair genes in hereditary non-polyposis colorectal cancer patients. Nature Medicine 2: 169-174.
Mao L, Lee DJ, Tockman MS, Erozan YS, Askin F, Sidransky D., Microsatellite alterations as clonal markers for the detection of human cancer, Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Oct 11;91(21):9871-5
Mao, L. et al. (1996) Molecular Detection of Primary Bladder Cancer by Microsatellite Analysis. Science 271: 659-662.
Peltomaki P (2003) Role of DNA mismatch repair defects in the pathogenesis of human cancer. J Clin Oncol 21:1174-9
Ribic CM, Sargent DJ, Moore MJ, et al. Tumor microsatellite-instability status as a predictor of benefit from fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer. N Engl J Med 2003;349:247-57.
Rodriguez-Bigas MA, Boland CR, Hamilton SR, et al. A National Cancer Institute workshop on hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome: meeting highlights and Bethesda guidelines. J Natl Cancer Inst 1997;89:1758-62.
Vasen HF, Wijnen JT, Menko FH, Kleibeuker JH, Taal BG, Griffioen G, Nagengast FM, Meijers-Heijboer EH, Bertario L, Varesco L, Bisgaard ML, Mohr J, Fodde R, Khan PM (1996) Cancer risk in families with hereditary nonpolyposis colorectal cancer diagnosed by mutation analysis. Gastroenterology 110:1020-7
Watanabe T, Wu TT, Catalano PJ, et al. Molecular predictors of survival after adjuvant chemotherapy for colon cancer. N Engl J Med. 2001 Apr 19;344(16):1196-206 |
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